300104 UE "Hands on"- Kryopräparation biologischer Proben für ultrastrukturelle Studien (2018W)

In der Life-Science Community hat sich in den letzten Jahren eine gravierende Einbeziehung von Kryopräparationstechniken für mikroskopische und analytische Verfahren vollzogen. Die unmittelbare Kryoimmobilizierung lebender Proben in Kombination mit Tieftemperatur-Dehydrierung-und Fixierung (Gefriersubsitution) wurde zum neuen Qualitätsstandard für die Konservierung tierischer und pflanzlicher Geweben für die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), welcher neue Zugänge zu biologischen Fragestellungen eröffnet.
Der Kurs vermittelt an ausgewählten biologische Proben zwei wesentliche, in ihrer Wirkungsweise grundverschiedene, Einfriertechniken: Hochdruck-Kryofixierung und Plunge Freezing. Mittels dieser Techniken werden sowohl lebende als auch chemisch fixierte Proben (wie sie oftmals aus Feldversuchen zur Verfügung stehen) eingefroren. Die gefrorenen Proben werden unter Verwendung von Agitationsmodulen gefriersubstituiert, welche in die Kryokammern automatischer Gefriersubstitionssysteme (AFS) eingesetzt werden. Die Anwendung dieser, in userem EM Labor entwickelten Module, erlaubt es die Substitutionszeiten drastisch zu verkürzen (Siehe Literatur). Anschließend werden Proben in Kunstharzeinbettungen überführt. Hierbei kommt neben der Epoxidharzeinbettung auch eine, für Immunmarkierungen interessante, Tieftemperatureinbettung in Lowicryl zur Anwendung.
Das Schneiden der in Kunstharz eingebetteten Proben erfolgt in einem von den StudentInnen flexibel gestaltbaren Kursabschnitt, welcher Unterschieden in der praktischen Erfahrungen und im Geschick beim Umgang mit Ultramikrotomen Rechnung trägt.Die praktischen Arbeiten werden durch Vorlesungen und Diskussionen ergänzt, welche die Kryopräparation im Konzept der biologischen Wissenschaft und in ihrem Zusammenwirken mit anderen Methoden erläutert. Abschließend erfolgt die Evaluierung der Probenqualität im Licht- und Transmissionselektronenmikroskop und die Vorstellung der Ergebnisse in einem Kurzvortrag.
Der Kurs schafft somit die präparative Basis für komplexe experimentelle Ansätze, welche ultrastrukturelle Phenotypisierungen, Markierungsverfahren (Immunmarkierungen, in situ Hybridisierung), Elementananlyse (EDX and EELS) und, in zunehmenden Maße, auch NanoSIMS einschließen können.